WB 實(shí)驗(yàn)常見問題及問題排除

更新時(shí)間：2025-01-06 點(diǎn)擊次數(shù)：254

WB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果有黑點(diǎn)
原因	解決方案
封閉液未溶解	a. 確認(rèn)奶粉溶解。出現(xiàn)黑點(diǎn)最常發(fā)生的原因是奶粉沒有溶解，建議加入攪拌子，增加攪拌時(shí)間，或是溶解后離心取上清液使用。 b. 利用0.45 um的濾紙過(guò)濾溶液，以除去未溶解的牛奶顆粒及其他雜質(zhì)。 c. 改變封閉液的種類，如換為BSA。
溶液污染	a. 使用新鮮配制的溶液（跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗脫等緩沖液）或商業(yè)化溶液，以減少因長(zhǎng)菌長(zhǎng)霉造成的黑點(diǎn)。 b. 確認(rèn)一抗溶液是否保存不當(dāng)，可嘗試重新配置一抗溶液。
封閉液及抗體交互作用	一般脫脂牛奶中含有casein這種磷酸蛋白，可能會(huì)與磷酸化抗體產(chǎn)生非特異性結(jié)合，因此，如使用磷酸化抗體，建議用BSA作為封閉溶液，同時(shí)洗脫溶液也用TBST，如此可降低黑點(diǎn)或高背景值狀況。注：a. TBST是以Tris為基底，PBST是以磷酸鹽為基底的緩沖液，一般根據(jù)習(xí)慣選擇使用TBST或PBST。但如果是操作磷酸化抗體或最終顯色分析是用AP系統(tǒng)時(shí)，因?yàn)镻BST中的磷酸根會(huì)干擾，可能會(huì)造成高背景值或無(wú)信號(hào)，此時(shí)建議使用TBST緩沖液。另外，同一次實(shí)驗(yàn)中請(qǐng)使用一種緩沖液，不可封閉液用PBST，洗脫液用TBST。 b. 封閉時(shí)一般使用3-5%封閉溶液，依實(shí)驗(yàn)特性不同，可做微調(diào)；牛奶與BSA的選擇也是相同，掌握原則后，再依實(shí)驗(yàn)特性做微調(diào)，就能快速上手。
WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果信號(hào)過(guò)曝
原因	解決方案
蛋白樣品過(guò)量	降低蛋白上樣量。通常蛋白上樣量為30-50 ug，但有些蛋白的表達(dá)量較高（如beta actin），此時(shí)可依蛋白表現(xiàn)量，調(diào)整上樣量。
抗體過(guò)量	a. 提高抗體稀釋倍數(shù)。產(chǎn)生過(guò)曝時(shí)可提高一抗、二抗的稀釋倍數(shù)。 b. 減少孵育時(shí)間 c. 于4℃孵育
信號(hào)過(guò)曝	a. 縮短曝光時(shí)間。過(guò)曝時(shí)可縮短曝光時(shí)間，減少過(guò)曝的情形。 b. 使用低靈敏度的化學(xué)發(fā)光底物。過(guò)曝現(xiàn)象也有可能是因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光底物過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致的, 可選用靈敏度較低的化學(xué)發(fā)光底物來(lái)改善。注：化學(xué)發(fā)光底物一般有三種等級(jí)，femto（飛克, 10-15g）， pico（皮克, 10-12g）, 及plus（低皮克級(jí), 10-12~ 10-9g），可依蛋白表達(dá)量挑選適合的化學(xué)發(fā)光底物。
WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果拖帶
原因	解決方案
樣本不純，有雜質(zhì)污染	a. 重新離心樣品后取上清液使用 b. 使用較純的試劑配置細(xì)胞裂解液或購(gòu)買商業(yè)化產(chǎn)品 c. 使用Benzonase®核酸酶。Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白樣品粘度，減少核酸對(duì)跑膠的干擾 d. 全細(xì)胞或亞細(xì)胞萃取。使用商業(yè)化全細(xì)胞或亞細(xì)胞萃取試劑盒提取蛋白樣品，減少配制試劑溶液以及操作中分離不干凈的問題。
蛋白樣品過(guò)量	a. 降低蛋白上樣量。通常蛋白上樣量為30-50ug，但有些蛋白表達(dá)量較高(如beta actin)，此時(shí)可依蛋白表達(dá)量，進(jìn)行微調(diào)。 b. 延長(zhǎng)加熱時(shí)間。蛋白變性不, 也會(huì)使條帶成團(tuán)拖尾，此時(shí)可通過(guò)延長(zhǎng)樣品加熱時(shí)間（一般約5分鐘）及調(diào)整SDS（一般是2 %）比例, 使蛋白變性更。
信號(hào)過(guò)曝	a. 縮短曝光時(shí)間。過(guò)曝時(shí)可縮短曝光時(shí)間, 減少過(guò)曝的情形。
信號(hào)過(guò)曝	b. 使用低靈敏的化學(xué)發(fā)光底物。過(guò)曝現(xiàn)象可能是因?yàn)榛瘜W(xué)發(fā)光底物過(guò)強(qiáng)導(dǎo)致的, 可選用靈敏度較低的化學(xué)發(fā)光底物來(lái)改善。
WB條帶扭曲
原因	解決方案
膠沒配置好	a. 確保APS & TEMED 正常, 并新鮮配置膠體。 APS為起始劑，主要負(fù)責(zé)提供自由基供膠體進(jìn)行聚合反應(yīng)， APS粉末容易受潮，建議置于防潮箱保存，如果發(fā)生結(jié)塊，建議重新購(gòu)買。TEMED為催化劑，如果保存不當(dāng)或過(guò)期，也會(huì)影響膠體聚合，建議分裝。 b. 小心移除齒梳，避免造成加樣壁孔歪斜 c. 配完下層膠后，需用水或醇類將膠體壓平 d. 膠里面有雜質(zhì)/氣泡?？深A(yù)先用0.45 um濾紙過(guò)濾膠體溶液，混合膠體溶液時(shí)，應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
電流電壓?jiǎn)栴}	a. 避免用高電壓電泳使膠體過(guò)熱。 150V，過(guò)熱有霧氣，80-100V，上膠帶短、下層不勻。 b. 空的孔道加樣品緩沖液，使每個(gè)孔洞都有樣品且鹽類成分相近。 c. 避免孔洞中有雜質(zhì)，用高純度等級(jí)的化學(xué)藥品或用商業(yè)化試劑提取蛋白樣品，或在上樣前用跑膠緩沖溶液沖洗加樣孔。
轉(zhuǎn)膜問題	a. 膠體應(yīng)與膜密合，轉(zhuǎn)膜時(shí)小心滾壓膠體，使膠體與膜貼合緊實(shí) b. 轉(zhuǎn)膜時(shí)小心勿晃動(dòng)。有時(shí)出現(xiàn) 2個(gè)條帶是因?yàn)檗D(zhuǎn)膜時(shí)發(fā)生晃動(dòng)，產(chǎn)生疊影條帶呈啞鈴狀出現(xiàn)啞鈴最大的可能是膠沒有配置好，膠凝固后不均一，拔完梳子之后，某些孔道凸起不平整，可以試著注意膠體是否凝固（確認(rèn)試劑沒問題），拔梳子時(shí)注意不要讓孔道歪掉，loading前也可以再用running buffer沖洗孔道，另外還有一種可能是樣品中含有太多雜質(zhì)，沒有離心下來(lái)，或沒有溶解，然后雜質(zhì)沉積在孔的中間，蛋白因此被推擠到兩邊。
條帶呈啞鈴狀	原因：出現(xiàn)啞鈴狀最可能是膠沒有配制好，膠凝固后不均，拔完齒梳之后，某些孔道凸起不平整，另一種可能是樣品中含有過(guò)多雜質(zhì)，沒有離心下來(lái)，或沒有溶解，導(dǎo)致雜質(zhì)沉積在孔的中間，蛋白因此被推擠到兩邊。解決方案：確認(rèn)膠體是否凝固，拔齒梳時(shí)注意不要讓孔道歪斜，上樣前可再用跑膠緩沖液沖洗孔道。
WB背景值較高
原因	解決方案
封閉不足	a. 提高封閉液濃度，確保封閉液覆蓋轉(zhuǎn)印膜，如使用5% 脫脂奶粉或BSA。 b. 增加封閉時(shí)間，一般情況會(huì)使用37℃封閉1小時(shí)，可視情況調(diào)整封閉的條件。 c. 使用BSA作為封閉液，同時(shí)搭配使用TBST的洗脫液來(lái)降低高背景值的狀況。
抗體問題	a. 抗體濃度太高。建議降低抗體濃度，并增加洗滌次數(shù)和時(shí)間。 b. 一抗孵育溫度過(guò)高，建議4℃孵育過(guò)夜。 c. 二抗的非特異性背景，可增加二抗對(duì)照，以陽(yáng)性對(duì)照組確認(rèn)二抗。 d. 洗脫不足，增加洗脫液體積和洗滌次數(shù)。
顯色問題	化學(xué)發(fā)光底物過(guò)多，建議調(diào)整化學(xué)發(fā)光底物，按說(shuō)明書加入適量的顯色底物。也可依據(jù)蛋白表達(dá)量的不同，選擇合適的化學(xué)放光底物。
膜的問題	a. 挑選合適的NC或PVDF膜。依據(jù)靶標(biāo)蛋白、想要呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及膜的特性，選擇出適合實(shí)驗(yàn)的材料。 b. 建議實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都必須注意讓膜保持濕潤(rùn)，特別是PVDF膜。 c. 在使用PVDF膜時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)浸潤(rùn)不均勻的情況，從而導(dǎo)致背景值比較高的情況。因此，建議使用PVDF膜前使用100% methanol浸潤(rùn)膜。
WB條帶非專一性
原因	解決方案
蛋白質(zhì)降解	a. 蛋白質(zhì)抑制劑或磷酸酶抑制劑 b. 冰上操作 c. 避免反復(fù)凍融
蛋白質(zhì)形成多聚糖	a. 使用現(xiàn)配的DTT/2-ME，并將加熱時(shí)間延長(zhǎng) b. 確認(rèn)樣本煮沸時(shí)的溫度達(dá)到95-100℃
確認(rèn)蛋白質(zhì)特性	查詢生物信息確認(rèn)蛋白是否存在后修飾、剪切體等。
抗體濃度過(guò)高或蛋白樣品過(guò)量	a. 調(diào)整蛋白上樣量為30-50 ug或減少上樣量 b. 增加抗體稀釋倍數(shù)
抗體非專一性結(jié)合	a. 增加洗膜次數(shù)與除垢劑強(qiáng)度 b. 設(shè)對(duì)照組確認(rèn)抗體專一性 c. 詢問抗體公司技術(shù)支持
抗體認(rèn)到輕重鏈的信號(hào)	a. 換不同宿主來(lái)源的一抗 b. 使用EasyBlot二抗
目標(biāo)信號(hào)微弱
原因	解決方案
蛋白問題	a. 了解靶標(biāo)蛋白的特性 ? 是否存在特異性? 可提取特定細(xì)胞器增加蛋白濃度，例：抽取核蛋白、膜蛋白、胞質(zhì)蛋白。 ? 是否存在組織特異性? 有些目標(biāo)蛋白只會(huì)在特定組織表達(dá)，這可降低樣本挑選的錯(cuò)誤率。 ? 是否有后修飾作用? 目標(biāo)蛋白后修飾分子量會(huì)變大，使抗體認(rèn)到的位置比估算分子量高。 ? 確認(rèn)靶標(biāo)蛋白在細(xì)胞株的表達(dá)量以及是否需加藥誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。 b. 增加蛋白質(zhì)上樣量。一般蛋白上樣量為20-30μg/孔, 如文獻(xiàn)已表明靶標(biāo)蛋白表達(dá)量低或是使用極少的上樣量（例如< 10μg），需增加上樣量來(lái)協(xié)助抗體偵測(cè)其信號(hào)。 c. 減少蛋白降解。 ? 細(xì)胞萃取時(shí)要加蛋白質(zhì)抑制劑或磷酸酶抑制劑，避免蛋白降解。 ? 在冰上操作蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)。 ? 避免反復(fù)凍融樣品(建議分裝)。 ? 新鮮制備新一批的樣本。
抗體問題	a. 調(diào)整抗體孵育條件。 ? 增加抗體量，例如原本使用1:1000稀釋，調(diào)整為1:500稀釋。 ? 增加孵育時(shí)間：將原37℃孵育1小時(shí)改成4℃孵育過(guò)夜。 b. 一抗二抗不相容。檢查二抗與一抗種屬是否有正確配對(duì)，要訣：“鼠配鼠兔配兔，isotype相配不出錯(cuò)"。 c. 過(guò)度洗脫。減少洗脫次數(shù)與時(shí)間：一般洗脫三次, 每次5-10分鐘即可。
轉(zhuǎn)膜問題	a. 檢查轉(zhuǎn)膜方向。轉(zhuǎn)膜方向錯(cuò)誤會(huì)讓蛋白往反方向移動(dòng)散逸在轉(zhuǎn)膜緩沖液里，方向正確才能讓蛋白粘附咋轉(zhuǎn)印模的孔洞里。 b. 根據(jù)分子量調(diào)整轉(zhuǎn)膜條件。大分子蛋白轉(zhuǎn)膜條件可調(diào)整為低溫過(guò)夜（濕式轉(zhuǎn)膜），小分子蛋白改用0.2 um的轉(zhuǎn)印膜，縮短轉(zhuǎn)膜時(shí)間。
封閉過(guò)度	a. 降低封閉液濃度：一般使用3-5%的牛奶或BSA做封閉液即可。 b. 降低封閉時(shí)間：一般封閉時(shí)間為30-60分鐘。 c. 換封閉液，可使用商業(yè)化封閉液（GTX30963）可協(xié)助避免這個(gè)問題的發(fā)生。
化學(xué)發(fā)光底物失活或敏感度不夠	a. 使用現(xiàn)配的化學(xué)發(fā)光底物 b. 使用高敏感度的化學(xué)發(fā)光底物，例如使用飛克（GTX14698）等級(jí)的化學(xué)發(fā)光底物。 c. 增加曝光時(shí)間

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