腫瘤細胞培養(yǎng)是指從腫瘤組織中分離出腫瘤細胞，在體外模擬體內環(huán)境使其生長、增殖的技術。以下是腫瘤細胞培養(yǎng)的基本方法：

培養(yǎng)前準備

實驗器材：準備細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、離心管、顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺等。所有器材需經(jīng)過嚴格的清洗、消毒和滅菌處理，以防止微生物污染。

培養(yǎng)基：根據(jù)腫瘤細胞的類型選擇合適的培養(yǎng)基，如 RPMI - 1640、DMEM 等。培養(yǎng)基中通常需添加 10% - 20% 的胎牛血清，以提供細胞生長所需的營養(yǎng)物質和生長因子。此外，還需加入青霉素、鏈霉素等抗生素，以防止細菌污染，其終濃度一般為青霉素 100 U/mL、鏈霉素 100 μg/mL。

消化液：常用的消化液為胰蛋白酶 - EDTA 混合液。一般胰蛋白酶的濃度為 0.25%，EDTA 的濃度為 0.02%。

細胞取材與分離

取材：在無菌條件下，從手術切除的腫瘤組織中獲取標本。盡量選取腫瘤邊緣生長活躍的部分，避免取到壞死灶。將取下的組織放入含有預冷的、含抗生素的 PBS 緩沖液的無菌容器中，盡快送往實驗室進行處理。

分離：將腫瘤組織在超凈工作臺上用 PBS 緩沖液沖洗數(shù)次，去除血液和雜質。然后將組織剪成 1 - 2 mm3 的小塊，加入適量的消化液，在 37℃恒溫箱中消化 15 - 30 分鐘，期間輕輕搖晃容器，使組織塊與消化液充分接觸。當組織塊變得松散，大部分細胞解離下來時，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。通過濾網(wǎng)過濾細胞懸液，去除未消化的組織塊，然后將細胞懸液離心，轉速一般為 1000 - 1500 rpm，離心 5 - 10 分鐘，棄去上清液，得到腫瘤細胞沉淀。

細胞培養(yǎng)

接種：用適量的培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，調整細胞密度，一般為 1×10? - 1×10?個 /mL。將細胞懸液接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，使細胞均勻分布。然后將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，在 37℃、5% CO?的條件下培養(yǎng)。

換液：培養(yǎng)過程中，細胞會消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質，并產(chǎn)生代謝廢物。因此，需要定期更換培養(yǎng)基，以維持細胞的生長環(huán)境。一般每隔 1 - 2 天觀察細胞生長情況并更換培養(yǎng)基。當細胞生長至匯合度達到 80% - 90% 時，需要進行傳代培養(yǎng)。

細胞傳代

消化：吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用 PBS 緩沖液沖洗細胞 1 - 2 次，去除殘留的培養(yǎng)基和血清。然后加入適量的消化液，覆蓋細胞表面，在 37℃下消化 1 - 3 分鐘。當在顯微鏡下觀察到細胞變圓、間隙增大時，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。

吹打與接種：用移液管輕輕吹打細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來，形成細胞懸液。將細胞懸液轉移到離心管中，離心，轉速和時間與初次分離細胞時相同。棄去上清液，用適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，然后按照一定的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。

細胞凍存與復蘇

凍存：當細胞培養(yǎng)到一定數(shù)量時，為了長期保存細胞，需要進行凍存。將細胞消化成單細胞懸液，離心后棄去上清液，加入適量的凍存液（一般為含 10% DMSO、20% 胎牛血清的培養(yǎng)基），使細胞密度為 1×10? - 1×10?個 /mL。將細胞懸液分裝到凍存管中，密封好，然后按照一定的降溫程序進行凍存，一般先在 4℃冰箱中放置 30 分鐘，再放入 - 20℃冰箱中放置 1 - 2 小時，最后放入 - 80℃冰箱中過夜，次日轉移到液氮中保存。

復蘇：從液氮中取出凍存管，迅速放入 37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，使其在 1 - 2 分鐘內快速解凍。然后將細胞懸液轉移到離心管中，加入適量的培養(yǎng)基，離心，棄去上清液，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，接種到培養(yǎng)瓶中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。